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HRM分析试剂盒 (EvaGreen)(FP210)

厂家:天根生化科技(北京)有限公司
  目录号 规 格 价 格
FP210-02 20μl×500次 2480元
FP210-01 20μl×125次 720元

产品简介

本产品结合了饱和染料EvaGreen 和抗体酶的优点,是一款适用于高分辨率熔解曲线(High Resolution Melting,HRM)分析的专业试剂盒。本品是一种2× PreMix,PCR 反应液配制十分简单方便;具有分辨率高和模板高度适应性等特点。与SYBR Green 不同,EvaGreen 在高浓度情况下不会抑制PCR 反应;可以使双链PCR 产物的结合量达到饱和状态,所以称为“饱和染料”。不会产生SYBR Green 的“染料重排”现象,能够很好的区分扩增产物之间单个碱基的差异。本产品可用于已知SNP 分析,未知SNP 筛选,以及未知突变基因扫描和甲基化PCR 分析等研究。

产品特点

■ 高分辨率:采用EvaGreen 饱和染料,在饱和状态下具很高的熔解曲线分辨率,可以区分单个碱基的变异。

■ 高特异性:采用抗体修饰的热启动DNA 聚合酶,降低非特异性扩增,提高特异性。

■ 高稳定性:精心优化Buffer 体系,增加了熔解曲线的稳定性,提高结果可信度。

■ ROX 校正:单独包装的ROX 染料,使用更灵活,结果更准确。

储存条件

收到本产品后, 请立即置于-20 避光保存。从-20 取出使用时, 将冻存的2x HRM Analysis PreMix50×ROX Reference Dye溶解,然后轻轻颠倒混匀,待溶液完全均一后再行使用。如解冻后没有使用,须彻底混匀后重新冷冻(在解冻过程中盐会出现分层现象,未混匀进行冷冻,盐晶体的析出将会对酶造成损害)。如需一段时间内经常取用,可在28条件下储存3个月。避免反复多次冻融。

 

注意事项

1.本产品中含有荧光染料EvaGreen,保存本产品或配制PCR反应液时应避免强光照射。

2.如果试剂没有混匀,其反应性能会有所下降。使用时请上下颠倒轻轻混匀,请不要使用振荡器进行混匀,尽量避免出现泡沫,并经瞬时离心后使用。

3.引物纯度对反应特异性影响很大,建议使用PAGE级别以上纯化的引物。

420 μl反应体系中,基因组DNA模板的使用量一般小于100 ng,并尽量保持不同反应之间有相同的模 量。模板纯度,OD260/280 1.6~2.0OD260/230 1.5~2.0

5.由于HRM具有很高的灵敏性,因此在条件允许的情况下推荐使用50 ul反应体系,大的反应体系可以提高反应重复性,减少实验误差对熔解曲线的负面影响。

6.引物设计:较短的PCR产物可以提高HRM的分辨率;因此在设计PCR引物时,遵循普遍的原则外,尽量保持产物长度在80~120之间。SNP位点尽量处在PCR产物序列中间位置。


实验例

使用DP318 提取100 μl 人类血液样本,上样量50 ng,根据NCBI SNP 数据库,选取FEN1 基因的已知SNP (rs174538) 使用Roche LightCycle480 检测,结果如下:



实验结果显示,HRM Analysis Kit 的相同基因型熔解曲线重复性高,不同基因型分辨明确,不存在误判,是理想的

SNP 位点分析方法。

SNP 信息:......CGGAAGAACACGTCG[A/G]CAGGAGCAGGCGCCT...... (Allele Frequency:A=0.314,G=0.686)

引物:扩增108 bp 的片段(所用引物FEN1_F:CCTCAACGCTCTCACCATTTTG;FEN1_R:GGCACTTCCTTTTCCGGTTGTG)


实验例

根据NCBI SNP 数据库,选取已知的SNP 进行检测,检测的SNP 信息如下:

RefSNP number:rs174538Gene Name:FEN1 (flap structure-specific endonuclease 1)序 列:CGCTCCGCCACCGGAAGAACACGTCG[A/G]CAGGAGCAGGCGCCTAGCACAACCGAllele Frequency:A=0.314,G=0.686根据该SNP 位点两侧序列信息,设计引物:FEN1_F:CCTCAACGCTCTCACCATTTTG;FEN1_R:GGCACTTCCTTTTCCGGTTGTG;扩增PCR 产物长度为108 bp。配置反应体系,在Roche LightCycle480 仪器上运行,检测24 个个体,结果如下:


图1. 对已知SNP 进行检测,NCBI Assay ID 为ss869699;PCR 产物长度为108 bp;24 个检测样本。Roche LightCycler480 仪器运行, 收集熔解曲线信号参数:Ramp Rate 0.05;Acquisitions 12; Gene scanning 方法分析。结果中可以看出,HRM Analysis Kit 的不同基因型分辨明确,相同基因型熔解曲线重复性高,不存在误判。

仪器要求

HRM 对仪器的要求较高,ABI 7500 Fast ,ABI 7900HT,Roche LightCycler 480,Qiagen Roter-Gene 等配合专用软件可进行HRM 实验。

地址:北京市海淀区西小口路66号东升科技园(北领地)C7-3 电话:800-990-6057
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