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HRM法基因定性分析原理

发布日期:2016年09月18日   浏览次数8240

    基因的定性分析,就是指诸如单核苷酸多态性(SNP)分析、基因突变分析、纯合子筛查等基因分析方法。与基因的定量分析不同,定性分析大多无需知道基因的表达量,而是需要了解样本中目的基因的序列。传统的基因定性分析可用Southern Blot、PCR、DGGE、RFLP和测序等方法,但是这些方法要么耗时较长,要么通量较低,要么精度不够。高通量测序及基因芯片技术虽然能够满足高精度、高通量的检测要求,但是对于只针对特定位点的研究来说成本较高。长久以来,科研人员都在寻找一种简便而精确的、可在实验室操作的基因定性分析方法。

    虽然荧光定量PCR是应基因定量的要求而发展出来的技术,但是随着化学等其他学科的进步,现今利用荧光定量PCR技术进行基因的定性研究已经成为现实。与传统方法相比,利用荧光定量PCR检测基因序列更加准确和高效,在目前的基因定性分析中有着越来越广泛和深入的应用。

    最先应用于定性检测的是荧光探针。因为荧光探针的分辨率高,能够区分单碱基差异,适合SNP或者基因突变的检测。根据特定位点的两种不同序列设计两种不同的探针,分别用两种荧光标记,再对目的样本进行荧光定量PCR检测,由两种荧光信号的比例即可计算不同序列的含量和比例。然而,荧光探针合成麻烦、周期长、成本高,与测序相比试验周期和成本并未明显降低。所以,人们一直寻找利用荧光染料进行基因定性检测的可能。饱和染料的发现,以及随之诞生的高分辨率熔解(High Resolution Melting,HRM)分析方法,为染料法基因定性分析提供了基础。

    常用的荧光染料(如SYBR Green等)在浓度高的时候会对PCR过程产生抑制,所以在荧光定量实验时的使用浓度较低。此时,染料不能占据DNA双链上的所有的位置,换句话说,染料与DNA的结合是不饱和的。这些染料称为“非饱和染料”。当制作熔解曲线时,随着温度的上升,双链逐渐解链,染料会从已解开的单链上脱落,然后结合到临近的尚未解链的双链中没有染料的小沟上去,继续发出荧光。这种现象称作染料的“重排”(图1)。重排导致在较小的温度变化范围内,虽然DNA双链的解链程度不同,但荧光值是几乎不变的;也就是说,熔解曲线不能精确反应双链的解链情况。所以,对于非饱和染料,其熔解曲线分辨率相对较低,只能区分特异性或非特异性的产物,不能分辨单碱基的差异。

    与此相对,另外一些荧光染料如LC Green、Eva Green等,对PCR的过程无抑制,所以在体系中可以以高浓度存在。此时,DNA双链中的所有可结合位点内都会有染料分子存在,染料与DNA的结合呈饱和状态,所以这种染料称为“饱和染料”。在温度上升、双链解链、染料脱离的过程中,未解链的双链部分不存在染料可以结合的位点,染料不能发生重排。所以,使用饱和染料制作的熔解曲线分辨率很高,可以精确反映DNA双链随着温度的解链情况,不同熔解曲线的形状就代表了不同的序列,精度可以达到单碱基差异的区分。

 
图1. 非饱和染料(如SYBR Green)的“重排”现象导致在温度变化幅度小、双链部分变性时,荧光信号无明显变化。而饱和染料则没有重排现象,能够分辨单碱基差异。

    采用饱和染料的HRM分析方法与探针法相比消除了背景信号,灵敏度进一步提高;同时,实验设计更加方便,操作更加简单,也无需合成和使用不同的荧光探针,调试时间更短,实验成本也更低,非常适合对于特定多态位点的实验室检测。
    根据HRM分析的这些特点和要求,TIANGEN开发了HRM分析试剂盒(FP210)。该试剂盒采用Eva Green饱和染料,使用抗体修饰的热启动DNA聚合酶及精心优化的缓冲体系,增加反应的特异性和熔解曲线的稳定性,具有高分辨率和高模板适应性的特点,特别适用于已知SNP分析、未知SNP筛选、突变基因扫描和甲基化研究等基因定性分析研究(图2)。


 
图2. 使用TIANGEN血液基因组DNA提取试剂盒(DP318)提取100 μl人类血液样本中的基因组DNA,以HRM分析试剂盒(FP210)进行PCR检测。检测24个不同个体,使用体系为20 μl,模板量为50 ng。结果显示,相同基因型熔解曲线重复性高,不同基因型分辨明确,不存在误判。可以看到,TIANGEN的HRM分析试剂盒是进行SNP检测的理想试剂。

检测的SNP信息如下:
RefSNP number:rs174538
Gene Name:FEN1(flap structure-specific endonuclease 1)
序列:CGCTCCGCCACCGGAAGAACACGTCG[A/G]CAGGAGCAGGCGCCTAGCACAACCG
Allele Frequency:A=0.314 G=0.686
根据该SNP位点两侧序列信息,设计引物:
FEN1_F:CCTCAACGCTCTCACCATTTTG;FEN1_R:GGCACTTCCTTTTCCGGTTGTG
扩增PCR产物长度为108 bp。
使用仪器为Roche LightCycler 480,收集熔解曲线的参数为:Ramp Rate 0.05,Acquisitions 12,用Gene scanning的方法分析。

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